Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В первый год работы по проекту исследовали ионные каналы, метаболизм и внутрипопуляционные механизмы жизнедеятельности потенциально токсичных морских миксотрофных динофлагеллят. Работа выполнена с помощью мультидисциплинарного подхода и современных методов клеточной и молекулярной биологии, биохимии и биоинформатики на модельных видах жгутиконосцев Prorocentrum minimum из лабораторных культур Института цитологии РАН. Методами математической статистики (корреляционный анализ, непараметрический многофакторный анализ, метод главных компонент) оценивали многолетнюю (30 лет) динамику P. minimum в Балтийском море и размер экологической ниши этих жгутиконосцев. Методами мечения субстратов стабильными изотопами, масс-спектрометрии для изотопного анализа, в том числе масс-спектрометрии вторичных ионов в наномасштабе (NanoSIMS), и анализа транскриптомов динофлагеллят устанавливали причины успешного распространения этого вида в прибрежных водах, в том числе в Балтийском море. Экспериментальное исследование метаболизма динофлагеллят P. minimum позволило установить, что они способны ассимилировать азот и углерод аминокислот, в частности, глицина. Показано, что скорость поглощения азота глицина приблизительно равна скорости поглощения нитрата, когда эти субстраты присутствуют в среде в эквимолярных концентрациях. Установлено, что динофлагелляты способны поглощать также углерод глицина, но в меньшей степени, чем это ожидалось, исходя из его структуры и отношения азота к углероду в его составе. С помощью анализа транскриптомов определены основные ферменты – оксидазы аминокислот, которые могут участвовать в поглощении и метаболизме исследуемых субстратов. Впервые с помощью уникального метода NanoSIMS исследован вклад органических и неорганических субстратов в миксотрофный рост потенциально токсичных протистов на уровне единичных клеток. Показана приоритетная важность мочевины по сравнению с растворенными в воде нитратами для питания P. minimum. Установлено, что внесение мочевины в среду приводило к 30-40% подавлению поглощения жгутиконосцами нитрата. Показано, что отдельные клетки внутри популяции динофлагеллят демонстрируют существенную гетерогенность в отношении скорости поглощения питательных субстратов, а также степени ингибирования поглощения нитрата. Сделан вывод о том, что динофлагелляты-миксотрофы способны использовать в качестве источников азота неорганические и органические соединения, что является преимуществом в эвтрофированных прибрежных регионах, подверженных антропогенному загрязнению азотсодержащими веществами (Matantseva, Skarlato et al., 2016; http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2016.01310). Анализ транскриптомов двух штаммов P. minimum (CCMP1329 и CCMP2233) выявил присутствие последовательностей нуклеотидов, кодирующих белки, вовлеченные в поглощение мочевины и нитратов и первые этапы их ассимиляции у P. minimum. Идентифицированы последовательности двух семейств белков эукариотного происхождения, которые способны выступать в качестве посредника при транспортировке мочевины в клетку: это аквапорины MIP и селективные переносчики DUR3. Обнаружены последовательности, гомологичные переносчикам нитратов у растений (транспортер NRT1.1, низкоафинный транспортер NRT1.2, высокоафинный транспортер NRT2.1). Определены ферменты, ответственные за ассимиляционное восстановление нитрата (ассимиляционная нитратредуктаза, нитритредуктаза) и гидролиз мочевины на аммоний и бикарбонат (уреаза). Показано, что при поглощении мочевины азот и углерод попадают в клетку в соотношении 20:1 вместо ожидаемого в соответствии со структурой молекулы мочевины 2:1. Предложена гипотеза, объясняющая механизм изменения соотношения углерода и азота мочевины при ассимиляции этого вещества динофлагеллятами. Определено влияние спектра питательных субстратов на морфологию динофлагеллят и уровень транскрипции в их клетках. Показано, что при росте P. minimum на мочевине и аминокислотах клетки достигают наибольших и наименьших линейных размеров, соответственно; при этом среднее количество хлорофилла на клетку статистически не различается у динофлагеллят, выращенных на различных субстратах. Измерения уровня транскрипции показали, что в клетках, растущих на мочевине, он в несколько (до 10) раз выше, чем уровень синтеза РНК в клетках, растущих на неорганических субстратах. В ходе изучения механизмов ионного сигналинга, сопряженных с выходом P. minimum из инцистированного состояния, зарегистрированы и охарактеризованы участвующие в этом процессе ионные каналы методом локальной фиксации потенциала на мембране (пэтч-кламп) на уровне одиночных проводимостей. Изучение сложных покровов (амфиесмы) вегетативных клеток P. minimum, представленных плазматической мембраной и уплощенными амфиесмальными везикулами, внутри которых находятся текальные целлюлозные пластинки, показало, что P. minimum исключительно чувствительны к физическому стрессу: центрифугирование даже при низких скоростях (1200 и 2000 g) приводило к сбрасыванию старых покровов (экдизису) и образованию жизнеспособных сферопластов (Бердиева, Скарлато и др., 2016; www.tsitologiya.cytspb.rssi.ru/58_10/berdieva.pdf). Показано, что сферопласты, окруженные только плазматической мембраной, представляют собой удобные модельные системы для изучения клеточной и молекулярной биологии динофлагеллят и позволяют исследовать их ионные каналы методом пэтч-кламп. Эксперименты со сферопластами и временными цистами P. minimum показали, что ионы натрия и кальция во внешней среде необходимы для успешного выхода клеток динофлагеллят из инцистированного состояния, а их отсутствие оказывает выраженный отрицательный эффект на этот процесс. Выдвинуто предположение об участии кальциевого и натриевого сигналинга в процессе выхода динофлагеллят из цист. Назван предположительный ряд ионных каналов, участвующих в этом процессе: прежде всего, это потенциал-управляемые натриевые и кальциевые каналы из семейства четырехдоменных потенциал-управляемых катионных каналов (ЧД ПКК) и механочувствительные катионные каналы. С помощью метода пэтч-кламп получены первые экспериментальные данные о наличии у P. minimum катион-неселективных каналов высокой проводимости, которые по ряду электрофизиологических характеристик близки к механочувствительным каналам животных. Зарегистрированы натрий-проводящие каналы без выраженной потенциал-управляемости. Идентифицирован ряд генов, предположительно отвечающих за выход клеток динофлагеллят из инцистированного состояния. Анализ баз данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 10 видов динофлагеллят (в том числе P. minimum) выявил наличие у них генов, кодирующих порообразующие субъединицы катионных каналов, потенциально участвующих в ионной регуляции процесса выхода клеток из инцистированного состояния: TRPV, TRPP, ЧД ПКК. Идентифицированы аминокислотные последовательности ЧД ПКК, содержащие все четыре структурных домена. С помощью биоинформатических подходов охарактеризованы важнейшие функциональные детерминанты этих каналов: селективный фильтр, сегменты S4 и участок, гомологичный области инактивационных ворот (Поздняков, Скарлато, 2016; www.tsitologiya.cytspb.rssi.ru/58_11/pozdnyakov.pdf). На основании анализа первичной структуры этих детерминант сделан вывод о том, что среди ЧД ПКК динофлагеллят обнаруживаются: 1) катионные каналы с селективным фильтром, характерным для кальциевых каналов; 2) каналы с сегментами S4, характерными для потенциал-управляемых каналов; 3) каналы с сегментами S4, характерными для потенциал-неуправляемых каналов; 4) каналы, у которых структура участка, гомологичного инактивационным воротам, свидетельствует о возможности их быстрой инактивации; 5) каналы, у которых структура участка, гомологичного инактивационным воротам, не характерна для каналов с быстрой инактивацией. Кроме того, идентифицированы сайты связывания ЧД ПКК с кальмодулином. Полученные данные свидетельствуют о том, что структурно-функциональное разнообразие ЧД ПКК динофлагеллят сопоставимо с таковым у животных. Экспериментально изучены спектр белков стресса у динофлагеллят P. minimum и их экспрессия при изменении солености и температуры воды. Предварительные результаты свидетельствуют о том, что при изменении солености до 8‰ по сравнению с контролем (17‰) происходит увеличение синтеза гемоксигеназы первого типа (HSP32). При изменении солености до 4 и 35‰ существенных вариаций синтеза гемоксигеназы-1 не наблюдалось. Белок теплового шока 70 кДа выявлен не был. Полученные результаты подтверждают высказанную нами ранее гипотезу (Telesh, Schubert, Skarlato, 2013) о том, что характер экспрессии белков теплового шока у протистов, в том числе у динофлагеллят, может отличаться от такового у многоклеточных организмов. Исследование влияния солености и температуры среды на клеточный цикл, смертность, синтез ДНК и РНК показало, что в целом клеточный цикл P. minimum устойчив к температурному и соленостному стрессу. Установлено, что клетки P. minimum при критической солености 8‰ проявляют повышенную биосинтетическую активность и демонстрируют сравнительно низкий уровень гибели; выявлена интенсификация синтеза РНК в фазе G1 клеточного цикла и увеличение синтеза ДНК в фазе S. В результате статистического анализа многолетней базы данных о морских эукариотных микроорганизмах в водах Балтийского моря установлено, что преимущественно вспышки «цветения» воды в результате развития динофлагеллят P. minimum имели место при солености воды 7.9±1.8‰ и температуре 20.8±3.7 °C. Экологическая ниша инвазийного вида P. minimum и близкородственных аборигенных видов жгутиконосцев определена как комплекс оптимальных для данного вида условий окружающей среды, в том числе: температура воды, соленость, pH, концентрация биогенных элементов (соединения азота, фосфора и кремния; общий фосфор, TP; общий азот, TN), соотношение TN/TP и тип местообитания, при которых регулярно наблюдалось его массовое цветение. Показано, что P. minimum обладает более широкой экологической нишей, чем другие виды рода Prorocentrum в Балтике, предположительно благодаря эффективным клеточным адаптационным стратегиям (Telesh et al., 2016; http://dx.doi.org/10.1016/j.hal.2016.09.006). В 2016 г. участниками проекта опубликованы 4 статьи в ведущих отечественных и международных научных журналах, индексируемых в системах Web of Science, Scopus и РИНЦ; в том числе, 2 статьи в журналах категории Q1: «Frontiers in Microbiology» (IF=4.165) и «Harmful Algae» (IF=2.664). Результаты обнародованы в 4 устных и 3 стендовых докладах на английском языке на трех международных конференциях. В рамках проекта выполнялась работа над магистерской диссертацией С.А. Печковской «Влияние спектра доступных источников азота на физиологию и морфологические параметры динофлагеллят» и двумя кандидатскими диссертациями: (1) аспиранта М.А. Бердиевой: «Структурно-функциональная организация ядра и цитоплазмы в жизненном цикле динофлагелляты Prorocentrum minimum» и (2) м.н.с. О.В. Матанцевой: «Клеточные механизмы и регуляция миксотрофии у динофлагеллят Prorocentrum minimum». Завершена работа над кандидатской диссертацией И.А. Позднякова «Катионные каналы динофлагеллят: выявление разнообразия и разработка экспериментального подхода для исследования функциональной активности»; защита назначена на 23.12.2016 г.; научный руководитель – г.н.с., д.б.н. С.О. Скарлато (руководитель проекта).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В результате анализа транскриптомов потенциально токсичных динофлагеллят Prorocentrum minimum и Amphidinium carterae у этих жгутиконосцев впервые идентифицированы гомологи белков, вовлеченных в миксотрофное питание. Выявлены гомологи белков, участвующих в транспорте мочевины (транспортеры DUR3, аквапорины MIP), нитрата (транспортеры NRT1.2 и NRT2.1), глюкозы (транспортеры GLUT) и глицина (транспортеры CAT1 и GLYT), а также белков, опосредующих метаболизм этих соединений в клетках: гомологи нитрат- и нитрит-редуктазы, уреазы, белков комплекса декарбоксилирования глицина и функционально сопряженной с ним серин-гидроксиметилтрансферазы. Кроме того, выявлен полный спектр ферментов цикла Кальвина-Бенсона. Таким образом, получена информация, необходимая для изучения миксотрофии динофлагеллят методами молекулярной биологии (Matantseva, Pozdnyakov, Voss, Liskow, Skarlato, 2018; Protist; IF=2.794). Определен относительный вклад органических и неорганических субстратов в питание потенциально токсичных миксотрофных динофлагеллят в среде, где эти субстраты присутствуют одновременно. Установлено, что транспорт азота мочевины и глицина в клетки P. minimum в два раза эффективнее конкурентного транспорта нитрат-ионов в условиях избыточного содержания азота в среде. При этом вклад мочевины и глицина в азотное питание динофлагеллят составляет до 70% в условиях, когда один из органических источников и нитрат-ионы присутствуют в среде в равных по азоту концентрациях. Показано, что углерод органических соединений (мочевины и глицина) играет незначительную роль в питании динофлагеллят, составляя менее 2% всего углерода, поглощаемого клетками (преимущественно в неорганической форме бикарбонат-ионов). Наблюдаемое разобщение ассимиляции азота и углерода органических соединений (азот ассимилируется в гораздо большей степени, чем углерод) объяснено на основании данных о белках, предположительно вовлеченных в метаболизм мочевины и глицина, которые получены в ходе биоинформатического анализа транскриптомов (Matantseva, Pozdnyakov, Voss, Liskow, Skarlato, 2018; Protist; IF=2.794). На примере генов nrt2.1 и dur3 (гены высокоаффинных транспортеров нитрат-ионов и мочевины, соответственно) разработан подход к конструированию праймеров для амплификации фрагментов генов динофлагеллят, учитывающий их предположительную экзон-интронную организацию. Получены и успешно протестированы с помощью стандартной методики ПЦР и RT-qPCR праймеры к генам nrt2.1 и dur3 у P. minimum, которые будут использованы для дальнейшего изучения экспрессии генов у динофлагеллят с помощью ПЦР в режиме реального времени (Pechkovskaya, Matantseva, Filatova, Skarlato, Telesh, 2017; Protistology 11 (3): 135-142). Широкомасштабное сравнение четырехдоменных каналов динофлагеллят с их гомологами других линий эукариот позволило продемонстрировать не только уникальные структурные особенности этих каналов у динофлагеллят, но и проследить эволюцию всего семейства четырехдоменных катионных каналов эукариот, а также реконструировать некоторые структурно-функциональные особенности предкового четырехдоменного канала эукариот (Pozdnyakov, Matantseva, Skarlato, 2018; Scientific Reports; IF=4.259). Исследования влияния ионного состава наружной среды на выход клеток P. minimum из инцистированного состояния (экдизис) выявили определяющую роль ионов кальция в этом процессе. Отсутствие ионов кальция в наружном растворе приводило к практически полному подавлению экдизиса. Выдвинуто предположение о том, что в процесс экдизиса динофлагеллят вовлечены кальциевые каналы плазматической мембраны. Для определения роли внутриклеточного кальция в процессе выхода клеток из цист проведены эксперименты с аппликацией ингибитора кальциевой АТФазы эндоплазматического ретикулума – тапсигаргина. Показано, что тапсигаргин в концентрации 10 мкМ вызывает повышение уровня экдизиса в культуре P. minimum. Таким образом, можно предполагать, что повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, необходимое для инициации экдизиса, связано как с повышением проницаемости плазматической мембраны для этих ионов, так и с выходом кальция из внутриклеточных депо (Pozdnyakov, Matantseva, Berdieva, Skarlato, 2017). В ходе исследований динофлагеллят P. minimum с использованием методов флуоресцентного мечения и иммуноцитохимии, конфокальной и электронной микроскопии получены данные о структурно-пространственной организации цитоскелета этих протистов. Подтверждено отсутствие кортикального микротрубочкового цитоскелета; впервые продемонстрированы особенности распределения различных форм актина в клетках P. minimum. Выдвинута гипотеза о том, что актин может играть замещающую роль в отсутствие кортикальных микротрубочек, будучи цитоскелетной основой архитектуры клеток. Этот белок может быть вовлечен в смену сложных клеточных покровов – экдизис. Полученные результаты позволили выдвинуть несколько гипотез о возможных механизмах участия F-актина в процессе экдизиса: 1) прямое действие кортикальных актиновых филаментов (сократительный механизм), 2) опосредованное участие путем регуляции выхода кальция из внутриклеточного депо, 3) блокирование экдизиса вследствие невозможности подготовиться к процессу формирования новых клеточных покровов, в который может быть вовлечен F-актин. Особое внимание было уделено внутриядерному пулу актина; показано, что его основой является мономерный актин; он концентрируется в нуклеоплазме, формируя сеть вокруг хромосом. Также выявлено значительное количество G-актина в ядрышке (Berdieva, Pozdnyakov, Matantseva, Knyazev, Skarlato, 2018; Phycological Research; IF=1.338). Экспериментально исследовали реакцию жгутиконосцев P. minimum, акклимированных к солености 17‰, на краткосрочный стресс соленостью 4, 8 и 35‰, изучив их смертность, изменения в клеточном цикле и структуре хромосом, синтез ДНК и РНК. Доля мертвых клеток в популяции P. minimum после стресса критической соленостью 8‰ была ниже по сравнению со смертностью при других режимах солености. Соленостный стресс вызывал лишь незначительные изменения жизненного цикла. На ультраструктурном уровне эффект был выявлен и для тонкой организации хромосомного аппарата жгутиконосцев: при солености 4 и 8‰ изменения были очевидными, но обратимыми. Обнаружен повышенный синтез РНК и ДНК у P. minimum при соленостном стрессе, что может рассматриваться как «компенсаторная реакция», ускоряющая метаболические (синтетические) процессы у этих протистов при обитании в условиях критической солености воды. Повышенный синтез РНК на стадии G1 и дополнительная репликация ДНК на стадии S жизненного цикла, вероятно, повышают устойчивость динофлагеллят к соленостному стрессу, что проявляется в относительно низкой смертности клеток при солености 8‰ (Skarlato, Filatova, Knyazev, Berdieva, Telesh, 2017; Estuarine, Coastal and Shelf Science; online 11 July 2017; https://doi.org/10.1016/j.ecss.2017.07.007 ; IF=2.176). Выполнена оценка влияния температурного стресса на выживаемость, клеточный цикл, экспрессию белков стресса, синтез ДНК и РНК у P. minimum. Методом проточной цитофлюориметрии показано, что при стрессе, вызванном повышением температуры культивирования с 25°С до 37°С или 42°С на срок от 15 до 60 мин не было обнаружено существенных изменений клеточного цикла, при этом гибель клеток увеличивалась с ≤1% в контроле до 2-12% при 37°С и 4-22% при 42°С. Наряду с этим, после повышения температуры P. minimum демонстрировали способность увеличивать синтез ДНК (в 1.7-1.9 и 1.2-1.6 раза, соответственно) и особенно РНК (в 3.1-2.5 и 2.8-1.7 раза, соответственно) в первые 15-30 мин после воздействия. Изучена экспрессия стресс-белка гемоксигеназы типа 1 у P. minimum при стрессе соленостью 4, 8 и 35‰. При изменении солености с 17‰ (контроль) до 8‰ наблюдалось увеличение синтеза белков стресса как на уровне 32 кДа (в 5.8 раза по данным денситометрии), так и на уровне 70 кДа (в 1.5 раза). Достоверного изменения синтеза белков стресса при солености 4 и 35‰ не наблюдали. Обнаруженные эффекты на отдельных стадиях жизненного цикла важны для сохранения жизнеспособности и нормального развития популяции P. minimum. Специфика структурно-молекулярной организации потенциально токсичных морских динофлагеллят, в том числе, экспрессия белков стресса, оценена с точки зрения возможности использования этих данных для решения актуальных вопросов биомедицины (Князев, Печковская, Скарлато, Телеш, Филатова, 2018; Журнал эволюционной биохимии и физиологии, Т. 54; IF=0.316). Показано, что усиление синтеза ДНК и РНК в ответ на внешний стресс представляет собой одну из эффективных стратегий экологической адаптивности динофлагеллят. Эта адаптивная стратегия обусловлена также и другими клеточными и физиологическими характеристиками: малым размером клеток, планктонным образом жизни, быстрым ростом популяций, высокой скоростью эволюционных преобразований, способностью к миксотрофии и формированию цист для переживания неблагоприятных условий. Сочетание этих важнейших характеристик способствует успешному вселению потенциально токсичных динофлагеллят в прибрежные морские сообщества, их массовому развитию там и формированию вредоносных «цветений» вследствие ярко выраженных конкурентных преимуществ этих протистов в нестабильных условиях солоноватоводных эвтрофированных местообитаний (Скарлато, Телеш, 2017; Биология моря 43 (1): 3-14; IF=0.526). В 2017 г. участниками проекта опубликованы 6 статей, в том числе 5 статей в научных журналах, индексируемых в Web of Science, Scopus и РИНЦ; из них 1 статья в журнале категории Q1: «Estuarine, Coastal and Shelf Science» (IF=2.176). Сданы в печать и находятся на рецензировании 2 статьи в международных журналах. Результаты обнародованы на 6 российских и международных конференциях в виде 10 докладов, в том числе: 1-м приглашенном, 3-х устных и 6-и стендовых. Защищена 1 кандидатская (И.А. Поздняков) и 1 магистерская диссертация (С.А. Печковская); еще 1 кандидатская диссертация (О.В. Матанцева) подготовлена и представлена в Диссертационный совет на базе ИНЦ РАН. Основные статьи в СМИ о результатах проекта: (1) https://www.gazeta.ru/science/news/2017/07/26/n_10353368.shtml (2) http://www.rscf.ru/ru/node/2426 (3) https://ria.ru/science/20170726/1499195172.html (4) http://fano.gov.ru/ru/press-center/card/?id_4=38375 (5) https://www.5-tv.ru/news/168493/ (6) https://78.ru/articles/2017-11- 28/v_finskom_zalive_uchenie_obnaruzhili_kriticheskii_uroven_koncentracii_vodorosleiubiic (7) https://iz.ru/676793/2017-11-29/finskie-uchenye-nashli-opasnye-vodorosli-v-baltiiskom-more

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г. исследовали миксотрофное поглощение органического и неорганического азота в форме мочевины, глицина и нитрат-ионов клетками динофлагеллят, механизмы ионного сигналинга в процессе эксцистирования, пластичность жизненного цикла и клеточные механизмы адаптации потенциально токсичных миксотрофных динофлагеллят Prorocentrum minimum к стрессовым условиям; моделировали динамику популяций этих микроорганизмов с учетом их трофической гетерогенности. Экспериментально установлено, что добавление аммония, мочевины, глицина и их сочетаний в различных концентрациях в качестве дополнительных источников азота к культивируемым на нитрате клеткам динофлагеллят P. minimum приводит к изменению уровня синтеза РНК. Показано, что эти изменения могут быть связаны с активизацией экспрессии генов, вовлеченных в азотный метаболизм: в частности, генов транспортеров мочевины (dur3) и нитрата (nrt2.1). Анализ методом РТ-ПЦР выявил различия в экспрессии генов транспортеров dur3 и nrt2.1 в зависимости от используемых источников азота (нитрат, аммоний, мочевина и смесь мочевины и аммония) и концентрации этих соединений. Изменение уровня синтеза РНК и экспрессии генов транспортеров сопровождалось изменением морфологических параметров клеток. Статистический анализ, выполненный методом главных компонент, выявил достоверную взаимосвязь между изменениями формы и размеров исследуемых клеток и используемыми азотсодержащими субстратами (Печковская, Матанцева, Филатова, Телеш, Скарлато, 2018). Установлено, что в среде с равным по азоту содержанием глицина и нитрата скорость потребления глицина динофлагеллятами вдвое превышает скорость поглощения нитрата. Показано, что мочевина и глицин используются этими микроорганизмами, главным образом, в качестве источников азота. Измеренное поглощение углерода этих органических веществ составляет 0.4% и 1.3%, соответственно, от уровня поглощения неорганического углерода, что в 14-20 раз меньше ожидаемого на основании структуры молекул мочевины и глицина. В транскриптомах P. minimum выявлены последовательности, которые кодируют гомологи белков, принимающих участие в метаболизме мочевины и глицина. Выявлено разобщение ассимиляции динофлагеллятами азота и углерода органических веществ и продемонстрировано, что оно может снижать общую эффективность поглощения необходимого для фотосинтеза неорганического углерода из окружающей среды (Matantseva, Pozdnyakov, Voss, Liskow, Skarlato, 2018; PROTIST; IF=2.794; https://doi.org/10.1016/j.protis.2018.05.006). Для оценки способности к миксотрофному питанию протистов Балтийского моря из различных таксономических групп проведен скрининг транскриптомов фотосинтезирующих видов протистов на наличие последовательностей, кодирующих гомологи белков-транспортеров мочевины (DUR3, SLC14) и ферментов уреазы, аллофонат гидролазы и карбоксилазы мочевины, участвующих в метаболизме этого органического соединения. Показано, что различные виды протистов из числа динофлагеллят, диатомовых и эвгленовых водорослей имеют гомологи белков, необходимых для транспорта и метаболизма мочевины. Сделан вывод о том, что миксотрофное поглощение органической мочевины широко распространено среди первичных продуцентов Балтийского моря, а антропогенное загрязнение мочевиной, вероятно, имеет еще большее значение для функционирования морских прибрежных экосистем, чем полагали ранее (Матанцева, 2018). Экспериментально показано, что популяции динофлагеллят гетерогенны в отношении поглощения мочевины и нитрата (т.е. состоят из нескольких функциональных групп), что не связано ни с общей физиологической активностью клеток, ни с их размером и стадией клеточного цикла. На основании полученных данных была построена модель динамики роста популяции миксотрофных динофлагеллят с учетом конкурентного поглощения ими органического (мочевины) и неорганического (нитрата) источников азота, а также внутрипопуляционной гетерогенности (Приложение 1). Установлено, что гетерогенность популяций динофлагеллят имеет решающее значение для понимания их динамики и вспышек массового размножения и должна учитываться при экосистемном моделировании (Матанцева, 2018). При исследовании роли ионов Na+, K+, и Ca2+ в эксцистировании динофлагеллят P. minimum показано, что замена наружной среды на среду без Na+ и K+ не имело статистически значимого эффекта на уровень эксцистирования в культуре. Однако наружная среда без ионов Ca2+ приводила к существенному снижению уровня эксцистирования клеток (3% по сравнению с 30% в контроле). Для проверки участия каналов кальциевых депо в процессе эксцистирования были проведены эксперименты с использованием блокатора кальциевой АТФазы эндоплазматического ретикулума (SERCA) – тапсигаргина. Показано, что добавление тапсигаргина может быть фактором, способствующим экдизису. Кроме того, методом локальной фиксации потенциала зарегистрированы кальций-проницаемые каналы плазматической мембраны – потенциальные участники процесса эксцистирования P. minimum. Проведен биоинформатический анализ первичной структуры одного из наиболее разнообразных семейств таких каналов у этих микроорганизмов – четырехдоменных потенциал управляемых катионных каналов (ЧДПКК). Результаты исследования дают основания предполагать, что ЧДПКК динофлагеллят являются кальциевыми каналами, многие из которых способны активироваться при изменении мембранного потенциала и регулироваться белком кальмодулином, а некоторые из них, подобно каналам Nav, могут быть способны к быстрой инактивации (Поздняков, 2018; Pozdnyakov, Matantseva, Skarlato, 2018; SCIENTIFIC REPORTS; IF=4.122; Q1; https://www.nature.com/articles/s41598-018-21897-7). В ходе прижизненных наблюдений за клетками лабораторной популяции P. minimum впервые показана возможность перехода динофлагеллят данного вида к половому процессу при стрессовых воздействиях. Рассмотрены условия появления стадий полового процесса (дефицит питательных веществ) и особенности морфологии клеток на этих стадиях (Бердиева, Калинина, 2018). Проведено изучение ультраструктуры ядер динофлагеллят P. minimum методами просвечивающей электронной микроскопии. Выявлены особенности тонкого строения хромосом в интерфазных ядрах P. minimum и определены два варианта организации, характерных для большинства хромосом. Показано, что хромосомам, относящимся к первому варианту, присуща четкая продольная дифференциация на зоны дисков и междисков. В составе этих хромосом обнаружены две морфологические области – центральная, или коровая, и периферийная область. В хромосомах, относящихся ко второму варианту организации, выявлены розеткоподобные комплексы, состоящие из хроматиновых фибрилл, расходящихся из электронно-плотного центра. Выдвинуто предположение о сохранении дискретных структурных единиц в составе хромосом динофлагеллят в отсутствие коровых гистонов, несмотря на значительные изменения в упаковке хроматина на низших уровнях (Golyshev, Berdieva, Musinova, Sheval, Skarlato, 2018; http://protistology.ifmo.ru/num12_4/golyshev_protistology_12-4.pdf). Выдвинута гипотеза о возможных вариантах расположения мембранных транспортеров в сложных клеточных покровах динофлагеллят. Обсуждены роль жгутикового кармана в обеспечении беспрепятственного входа питательных веществ в клетку и различия в трофических стратегиях голых и армированных динофлагеллят. Собраны и систематизированы сведения о строении и возможной роли пузулы – уникальной органеллы динофлагеллят с до сих пор не установленной функцией, которая связана со жгутиковым карманом (Kalinina, Matantseva, Berdieva, Skarlato, 2018; http://protistology.ifmo.ru/num12_1/kalinina_protistology_12-1.pdf). Успешно защищена кандидатская диссертация О.В. Матанцевой (основной исполнитель проекта) «Конкурентное поглощение и ассимиляция органических веществ и нитрат-ионов клетками динофлагеллят Prorocentrum minimum» по специальности 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология. Защита состоялась 02.03.2018 в Диссертационном совете Д002.230.01 на базе ИНЦ РАН; научный рук. д.б.н. С.О. Скарлато. Подготовлена к защите кандидатская диссертация М.А. Бердиевой (участник проекта) на тему «Структурно-функциональная организация клеток динофлагеллят Prorocentrum minimum в жизненном цикле» по специальности 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология. Успешная защита ВКР (аспирантской диссертации) состоялась 5 июля 2018 г. (оценка «отлично»); научный рук. д.б.н. С.О. Скарлато. При участии коллектива проекта проведена III Международная конференция «Актуальные проблемы планктонологии» с таксономическим тренингом для молодых ученых (24–28 сентября 2018 г., г. Зеленоградск, Калининградская область), в рамках которой работала специализированная секция по теме проекта РНФ – Секция № 4 «Адаптации планктонных организмов и сообществ к стрессовым воздействиям» (http://gboran.ru/kaliningrad-2018/ ). Опубликована обзорная статья, посвященная биологии потенциально токсичных морских миксотрофных эукариотных микроорганизмов и роли этих протистов в круговороте биогенных элементов в природе. Проанализированы современные концепции, описывающие динамику биоразнообразия протистов в градиенте факторов среды в прибрежных морских экосистемах, а также роль динофлагеллят в сообществах микропланктона. Обобщены сведения о биологии потенциально токсичных миксотрофных динофлагеллят Prorocentrum minimum, формирующих опасные «цветения воды», и их долговременной динамике в Балтийском море. Выполнен анализ результатов экспериментальных исследований реакции этих микроорганизмов на стрессовое изменение температуры и солености воды. Обобщены новейшие представления о миксотрофном метаболизме динофлагеллят и их внутрипопуляционной гетерогенности, клеточных и молекулярных адаптационных стратегиях, конкурентных преимуществах в сообществах микропланктона и особенностях их ярко выраженного инвазионного потенциала. Предложено и обосновано новое научное направление – «Трансляционная водная экология», которое подразумевает оперативный перенос в современную гидробиологию результатов новейших исследований, выполненных с помощью молекулярно-генетических и клеточно-биологических методов, что обеспечивает дополнительную фундаментальность результатов и их последующее эффективное использование в рыбохозяйственной практике, аквакультуре и рациональном природопользовании. Этот научный принцип может быть использован при разработке нового подхода к сохранению биоразнообразия и контролю качества природных вод в морских местообитаниях, подверженных интенсивному антропогенному стрессу (Skarlato, Telesh, Matantseva, Pozdnyakov, Berdieva, Schubert, Filatova, Knyazev, Pechkovskaya, 2018; http://protistology.ifmo.ru/num12_3/skarlato_protistology_12-3.pdf). Кроме того, в 2018 г. опубликованы еще 4 оригинальные статьи в журналах WoS & Scopus; вышли 3 статьи, принятые к печати в журналах WoS & Scopus в предыдущем году; опубликованы 6 статей в сборнике материалов конференции, 1 тезисы доклада и 3 популярные статьи в СМИ (http://рнф.рф/ru/node/3110; https://indicator.ru/news/2018/05/23/shodstvo-zhivotnyh-i-prostejshih/; https://www.gazeta.ru/science/news/2018/05/23/n_11568193.shtml?updated).